【AbMole】真菌检测实验中真菌染色——六胺银法

一、实验准备

材料与仪器

为了确保实验的顺利进行，我们需要精心准备以下材料与仪器：

• 溶液配制：包括精确称量的5%硼砂水溶液（5克硼砂溶于100毫升蒸馏水）、5%硝酸银水溶液（5克硝酸银溶于100毫升蒸馏水）以及3%乌洛托品水溶液（3克乌洛托品溶于100毫升蒸馏水）。这些基础溶液为后续复杂试剂的制备提供了坚实的基础。

• 特殊试剂的制备：六胺银贮备液是通过将3%乌洛托品水溶液缓慢倒入5%硝酸银水溶液中，并经过充分摇荡直至溶液变清亮而制得。此溶液需在4℃下避光保存，以维持其稳定性，通常可保存约6个月。应用液则是取贮备液25毫升，加入5毫升5%硼砂水溶液，现用现配，以确保其最佳染色效果。

• 其他重要试剂：如5%铬酸水溶液、1%亚硫酸氢钠水溶液、0.05%淡绿染液、0.1%氯化金水溶液以及3%硫代硫酸钠水溶液等，均按照严格的比例配制，以满足实验需求。

二、实验步骤

1. 切片预处理：首先，对切片进行常规的脱蜡至水洗步骤，以去除切片上的杂质和油脂，为后续染色做好准备。

2. 化学处理：将切片依次放入5%铬酸水溶液处理1小时，随后用自来水冲洗5分钟；再放入1%亚硫酸氢钠水溶液中处理30分钟，之后用自来水冲洗3分钟，并用蒸馏水充分洗涤，以去除多余的化学物质。

3. 六胺银染色：将预热至60°C的六胺银应用液倒入染色缸中，将切片放入并染色1小时。期间需密切观察切片颜色变化，当切片呈现淡黄色且显微镜下观察到淡棕色菌体时，应每隔5~10分钟观察一次，以精确控制菌体着色深浅，直至达到理想的显色效果。随后，用蒸馏水洗涤切片5~6次。

4. 后续处理：将切片放入0.1%氯化金水溶液中调色4分钟，再用蒸馏水洗涤1~2分钟；接着放入3%硫代硫酸钠水溶液中处理5分钟，以进一步稳定染色效果。然后自来水洗 1 分钟，蒸馏水洗 1 分钟。

5. 复染与封片：将切片放入淡绿染液中复染20秒，随后用流水冲洗20~60秒以去除多余染液。最后，经过95%酒精和无水酒精脱水、二甲苯透明处理，用树胶封片，以备观察。

三、染色结果

经过上述步骤处理后，真菌在显微镜下呈现为黑色，而背景则呈现为浅绿色。这种鲜明的颜色对比使得真菌在复杂的组织背景中易于识别和分析。

四、注意事项

1. 样本制备：在制备涂片时，必须细心操作，确保涂片薄而均匀。涂片应自然干燥，若需加热固定，则固定温度不宜过高，以免破坏标本形态，影响观察结果。

2. 氯化金调色：在氯化金调色过程中，务必在显微镜下观察切片颜色变化，以确保调色效果符合实验要求。

3. 实验器材清洁：实验中所用的玻璃器皿应预先用硫酸洗液浸泡并用蒸馏水冲洗干净，以去除可能干扰实验结果的杂质。同时，所有器材在使用前均需进行干燥处理，以避免水分对实验造成影响。

综上所述，真菌检测实验中的六胺银法是一种精确且有效的真菌染色方法。通过严格的实验步骤和注意事项控制，我们可以获得清晰、准确的染色结果，为真菌的识别和分析提供有力支持。